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摘要:以水牛胎儿为材料,从生殖腺中分离培养出牛原始生殖细胞,并对水牛原始
隆的影响因素进行了探讨.结果发现:(1)分离培养出的原生殖细胞(PGCs)呈集落
胞之间界限不清.细胞与周围的成纤维细胞界限明显;未分化的细胞表达碱性磷酸
因子;(2)收集妊娠29~100d牛胎)L28例,从生殖嵴(腺)或类似物中分离克隆水牛
落.结果表明,水牛原生殖细胞具有多能性特性,胎龄小于55d的水牛胎儿易于分离
分化发育成三个胚层细胞的潜力)的细胞.DeFelici等Ⅲ用EDTA/percoll法分离得
增刊李童等:水牛原始生殖细胞(PGCs)的分离培养及生物学特性的研究47
细胞仅存活3d.直到1992年Matsui等以分离附植后小鼠胎儿的原始生殖细胞为
得ES细胞.该细胞排列紧密,AKP(碱性磷酸酶)染色和SSEA一1(阶段特异性胚胎
呈阳性,并能形成类胚体,囊胚注射表明其具有参与嵌合体组织形成的能力,从而
实了PGCs同样可作为ES细胞分离克隆的原材料.目前,从PGCs中分离克隆ES
鼠口],猪?],人n和牛【1上已经取得重要进展,但在水牛方面,国内尚无该方面的报
本研究欲通过对水牛PGCs分离和培养的研究,对水牛PGCs生物学特性进行初步
和培养水牛PGCs的合适的胎龄和培养的基本方法,为进一步建立牛EG细胞系奠
1.2.1水牛胎儿的处理将胎牛用75的酒精消毒5~10min,打开腹腔,取出性腺,PBS
1.2.2PGCs 的分离培养将上述弄碎的性腺加入少量 PGC 细胞培养基,然后用 1mI
打将细胞分离后转移到 35mm 平皿中;如胎龄较大(体长≥12cm),则反复吹打后在
将分散的小组织块挑出来转移到 35mm 平皿中. 最终加培养液 1.5mI, 置于
多聚甲醛固定3Omin,再用PBS 洗涤3 次,每次5min,然后以添加硝基四氮唑蓝,室
1~3h;显微镜观察显色程度适当则用蒸馏水冲洗,终止反应,然后显微镜下观察.
非特异性染色.然后用PBS 洗涤2 次后分别加第一抗体,在37C 温育1h.PBS 洗涤
在实体显微镜下无菌剥离出牛胎儿生殖嵴/腺或类似物,分离出 PGCs,接种在饲养
显微镜下观察,PGCs 呈圆形或椭圆形,比周围的体细胞大,核大胞质少,所形成的类
有典型的ES 细胞集落形态,隆起,边缘整齐,集落中细胞排列致密,看不出明显的细
落边缘出现许多单个细胞,变得不整齐;有的集落中央出现发黑的若干团块,可能
凋亡的表现(图1).AKP 染色:牛PGCs 细胞集落着黑色,呈阳性,饲养层细胞不着色,
Oct 一4:牛PGCs 细胞进行免疫荧光检测呈阳性,出现绿色荧光(图3).
收集的 28 例牛胎儿分成 4 个阶段,胎龄小于 45d(体长小于 3.0cm)的7 例,全部出
适合分离培养 PGCs;胎龄过大(70d)较难分离或者说不适合做 PGCs 的分离,5
牛 PGCs 细胞集落形态与小鼠 EG 细胞相似,呈圆形或椭圆形,比周围的体细胞大,
隆起,细胞问界限不清,折光性强(图 1),与前人的描述基本一致,但形态学方面的鉴
AKP 染色通常作为 ES 及 EG 细胞鉴定的一种常用的染色方法.牛 EG 细胞 AKP
的学者认为牛 EG 细胞AKP 染色呈阳性,有的学者则认为 AKP 染色呈阴性.至于
细胞的 AKP 表达的差异,可能与不同的材料来源和牛 ES 细胞分化程度和表型有
发现AKP 染色呈阳性(图2),但AKP 活性能否作为牛多能干细胞的特异标记还有
Oct 一4 是维持细胞多能性的一个重要转录因子,是POU 家族成员,缺乏Oct 一4
亡,因为其ICM 不能正常发育,它在早期胚胎发育过程中起着重要的作用.同时,ES
的表达模式和基因剔除实验表明,Oct 一4 对维持ES 和EG 细胞未分化状态是必
种系细胞和未分化的干细胞中表达,当分化时表达中止,本实验对原代牛 PGCs 细
呈阳性,出现绿色荧光(图 3),可初步确定本实验分离培养的 PGCs 细胞具有多能
在家畜和人EG 细胞分离克隆时胎龄的选择方面,不同种动物有所不同.猪取24~
儿生殖嵴;山羊取25dpc 龄胎儿生殖嵴;人取5~9w 胎儿生殖嵴u.徐小明等的研究
时,发现胎龄大小对牛 EG 细胞分离克隆影响很大,分离与培养水牛 PGCs 的胎龄
臀长小于9.0cm).胎儿太大,生殖嵴已转变为性腺,PGCs 也大部分分化成生殖细胞,
到 PGCs.本实验结果表明,胎龄在 90dpc 以下的胎儿均能分离到水牛 PGCs 细胞,
胎儿的集落形成率明显高于 55dpc 以上的水牛胎儿,可以推断出胎龄在 29~
1.0~5.0cm)的水牛胎儿比较适合水牛PGCs 细胞的分离与培养,胎龄在55dpc 以上
克隆形成率明显下降,但仍然可以用于水牛 PGCs 细胞的分离与培养,胎龄大于
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